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大咖讲堂 | 相干拉曼散射显微术Ⅰ

发布时间:2019-11-29 16:15:49

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“一花一世界”,这句充满禅意的话在微观视野中得到完美诠释。而构成世间万千纷繁的原子由化学键联合为分子,不同的分子往往具有特异性的化学键振动,成为它们的指纹特征。相干拉曼散射(Coherent Raman Scattering,CRS)显微术便是通过探测目标分子的特征振动来提供成像所需的衬度, 同时基于非线性光学过程大大增强拉曼散射的信号,提高成像速率以及检测灵敏度的新型显微技术[1][2]


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▲水分子的三种振动模式示意



常见的光谱学手段按跃迁类型可分为两大类:电子光谱和振动光谱。电子光谱涉及电子在不同能级间的跃迁(如吸收光谱和荧光光谱等);振动光谱则作用于化学键或声子的振动(如红外吸收谱和拉曼散射谱)。如果把电子光谱比作静如处子但威力强大的内功;振动光谱则好似动如脱兔、招式鲜明的外家拳(见水分子振动示意图)。红外谱为直接共振吸收,信号很强但波长较长(中远红外),不利于含水环境的高分辨生物成像;我们通常讲的拉曼散射指自发拉曼散射过程,信号非常弱(比荧光低 8-10 个数量级),无法用于快速成像。相干拉曼是增强拉曼的手段之一,利用短脉冲激光的非线性效应实现增强,具有独特的优势和应用前景。

 

简单概括,相干拉曼散射显微术具有如下优点

 


  1. 免标记和分子特异性:CRS 成像的信号来源于目标分子本身,无需外源标记物,也避开了药物小分子等不易标记的问题,在活体(in vivo)观测上更具有优势;可对具有不同拉曼谱的分子进行选择性成像,比如生物样品里常见的脂质、蛋白、核酸和糖类等(如图 1);

  2. 较高的探测灵敏度:相比于自发拉曼,成像速度一般有 3-5 个数量级的提升,一定条件下可实现视频成像速度(每秒几十帧);

  3. 光学层析和三维扫描:类似多光子显微镜的光学层析和三维成像功能;且由于所用的激发波长一般在近红外,有较好的穿透深度和更小的光毒性。



根据非线性光学过程的不同,可将相干拉曼散射分为两种:相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering,CARS)和受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering,SRS)。虽然这两种非线性光学现象很早就被发现(上世纪 60 年代),但长期仅作为光谱学测量手段,直到 1999 年以及 2008 年,哈佛大学谢晓亮教授才分别将它们以实用显微成像技术推广开来[4][5]


自发与相干拉曼散射的能级示意图见图 2。自发拉曼只需要一束激发光,称为泵浦光(ωp),泵浦光子与分子发生非弹性碰撞,将部分能量转移给分子振动。因此散射出来的光相对于泵浦光将发生一系列的频率红移,称为斯托克斯光(ωs),对应到光谱仪中的一系列谱峰,成为该分子的指纹特征。泵浦和斯托克斯光子的频率差正好共振于化学键的振动频率(Ω=ωps),满足能量守恒。对于相干拉曼散射,需将泵浦和斯托克斯这两束激光同时作用于分子,当它们的频率差(拍频)共振于某个化学键的振动时,大量分子的同一个振动模式将被同步(相干地)激发起来,使得散射效率得到大大地增强。最终表现为:泵浦光减弱(受激拉曼损失,SRL)、斯托克斯光增强(受激拉曼增益,SRG),并且出现反斯托克斯(ωas=2ωp-ωs)的新频率分量(CARS)。自发拉曼散射与荧光、吸收等同属线性光学范畴,一般使用连续激光即可。相干拉曼与双光子荧光、二次谐波等都属非线性光学范畴,需使用超短脉冲激光。最常见的用于相干拉曼的光源是皮秒光参量振荡器(OPO),输出两路皮秒光,一束波长固定(如 1064nm),另一束波长在近红外区间可调,它们分别作为斯托克斯和泵浦光。调节激光波长使得我们可以改变待测拉曼频率,选择性地去探测不同的化学键/分子。


CARS 与 SRS 虽然都是三阶非线性光学过程,它们之间有明显的区别:CARS 是个四波混频过程,产生的光子具有第三种频率——反斯托克斯光子 ωas,因此只需采用合适的滤波片就可以简单地提取出来;而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之间的相互转化过程,泵浦光子的湮灭和斯托克斯光子的产生同时发生,但没有产生第三种光子;因此,通常用泵浦-探测技术中常见的调制解调的方式来提取信号,需要借助锁相放大器来实现。CARS 显微成像技术自 1999 年被发明以来,一直受困于非共振背景信号的干扰,典型的表现为光谱发生畸变(图 3)。在苦苦求索了近 10 年之后,谢教授课题组于 2008 年推出了 SRS 技术,完美地解决了上述问题。CARS 过程中能量被封锁于电磁场/光子中,电子跃迁可绕过分子振动直接通过虚能级产生;而 SRS 的发生依赖于光子能量与分子振动之间的交换,具有严格的共振吸收特征。因此 SRS 在光谱上与自发拉曼一致(图 3),在图像上也不再受非共振背景的困扰(图 4)。此外,SRS 的信号与分子浓度呈线性关系,更方便于定量解析复杂混合物体系中的各种化学成分。也因为这些特性,SRS 不断获得研究者们的青睐。



综上,CARS 与 SRS 都可以基于生物体中核酸、脂质和蛋白等物质自身的 Amide I、CH2、CH3 等化学键进行特异性成像。由于其免标记、高分辨率、快速成像以及三维扫描的优点,CRS 在病理检测、生物代谢、药物运输等方面具有广泛应用。具体的应用部分将在下一课堂详细讲解。

 



下面让我们先开启几个 CRS 的成像结果

 




参考文献:


1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,

doi:10.1117/1.JBO.19.7.071407 (2014)

 


2.Cheng, J. X. & Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science350,aaa8870,

doi:10.1126/science.aaa8870 (2015).


3.He, R. et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica 4,

doi:10.1364/optica.4.000044 (2016).


4.Zumbusch, A., Holtom, G. R. & Xie, X. S. Three-Dimensional Vibrational Imaging by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering. Physical Review Letters 82, 4142-4145,

doi:10.1103/PhysRevLett.82.4142 (1999).


5.Freudiger, C. W. et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.Science 322, 1857-1861,

doi:10.1126/science.1165758 (2008).


6.Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G. & Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.Nat Methods 8, 135-138,

doi:10.1038/nmeth.1556 (2011).


7.Lu et al., Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 112, E5902,

doi:10.1073/pnas.1515121112 (2015).


8.Ji, M. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.Science translational medicine 5, 201ra119,

doi:10.1126/scitranslmed.3005954 (2013).